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Analyse der Reinigungseffizienz mittels Gelelektrophorese
Gelelektrophorese
(Mengen müssen an das verwendete Gelsystem angepaßt werden)
Herstellung eines 15 %igen Polyacrylamidgels:
Zur Herstellung der Gele müssen Handschuhe getragen werden!
Trenngel:
- 15 ml 30 %ige Acrylamidfertiglösung
- 5.7 ml Trenngelpuffer (2 M Tris/HCl, pH 8.8)
- 150 ul 20 %iges SDS
- 9.3 ml H2O
+ 80 ul Ammoniumpersulfat (frisch ansetzen 0.2 g/ml)
+ 8 ul TEMED
Die Auspolymerisierung des Trenngeles dauert etwa eine Stunde.
Sammelgel:
- 2 ml 30 %ige Acrylamidfertiglösung
- 3.75 ml Obergelpuffer (0.5 M Tris/HCl, pH 6.8)
- 75 ul 20 %iges SDS
- 9.3 ml H2O
+ 90 ul 20 %iges Ammoniumpersulfat
+ 6 ul TEMED
In dieses Gel wird vorsichtig der Kamm für die Bildung der Auftragsslots hineingeschoben.
Elektrophoresepuffer:
50 ml 10facher Laufpuffer (30 g/l Tris (pH 8.3), 144 g/l Glycin)
+ 450 ml H2O
+ 2.5 ml 20 %iges SDS
Probenpuffer:
0.3 ml 20 %iges SDS
0.3 ml Mercaptoethanol (Arbeit unter dem Abzug mit Handschuhen!!)
0.4 ml Glycerin (blaue Spitze abschneiden)
1 Spatelspitze Bromphenolblau
10 ul der Proteinlösung (Proben F0-F2 1:10 verdünnt, Proben F3 und F4 unverdünnt) + 10 ul des SDS-haltigen Probenpuffers werden ca. 5 min gekocht und danach mit einer Mikroliterspritze auf das Gel aufgetragen. Zusätzlich werden ein Lysozymstandard sowie ein Molekulargewichtsmarker auf das Gel aufgetragen.
Laufbedingungen:
Pro Gel werden ca. 20 mA angelegt. Die Anfangspannung beträgt unter diesen Bedingungen etwa 80 V. Die Laufzeit liegt bei ca. 2-3 Stunden. Es wird eine Endspannung von 150-160 V erreicht.
Anfärben und Fixieren des Gels:
Das Gel wird für ca. 10 - 20 min in einer Coomassie-Blue-Lösung angefärbt und dann in eine Fixierlösung gelegt, bis die Banden gut erkennbar sind. Danach kann es unter Vakuum getrocknet werden.
Färbelösung: 40 % Methanol, 10 % Eisessig, 0.1 % Coomassie Brilliant Blue
Fixierlösung: 40 % Methanol, 10 % Eisessig
