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Temperaturabhängigkeit enzymatischer Reaktionen
Prinzip
Im folgenden Experiment wird die Temperaturabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit am Beispiel der sauren Phosphatase untersucht. Bei verschiedenen Temperaturen wird die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt. Sie entspricht praktisch Vmax, da die Reaktion bei nahezu Substratsättigung durchgeführt wird (siehe Exp. 7.1). Bei den verwendeten Bedingungen bleibt die Geschwindigkeit während der Inkubationsdauer konstant. Die Reaktion wird durch Zugabe von NaOH abgebrochen und das gebildete p-Nitrophenolat photometrisch gemessen.
Lösungen
- 0.2 M Na-Acetatpuffer, pH 5.0
- Saure Phosphatase aus Kartoffeln (11 µg/ml)
- 30 mM p-Nitrophenylphosphat
- 0.25 M NaOH
Ausführung
Die Inkubationen werden bei 20oC, 25oC, 30oC, 40oC und 50oC durchgeführt.
In 5 mit S20, S25, S30, S40 und S50 beschriftete RG jeweils 0.2 ml Puffer und 0.2 ml p-Nitrophenylphosphat pipettieren, gut mischen und je ein RG in die Wasserbäder mit den angegebenen Temperaturen stellen. Ein mit K30 beschriftetes RG mit gleichem Inhalt für die Kontrolle wird nur in einem Ansatz bei 30oC inkubiert.
In 5 weitere mit E20, E25, E30, E40 und E50 beschriftete RG je 0.3 ml der Enzymlösung und in ein RG 0.3 ml Puffer für die Kontrolle pipettieren. Diese RGs ebenfalls in die Wasserbäder stellen.
Nach 5 min in genau 0.5-minütigen Abständen 0.2 ml der vorgewärmten Enzymlösung zu den RGs mit vorgewärmtem Substrat geben und kurz mischen. Für die Kontrolle 0.2 ml Puffer zu K30 gegeben und bei 30oC inkubieren. Temperatur der Wasserbäder am Messthermometer ablesen, in Kelvin umrechnen und in untenstehende Tabelle eintragen.
Nach 10 min 3.4 ml NaOH aus der automatischen Pipette wiederum in genau 0.5-minütigen Abständen zu den Reaktionsansätzen geben. Die Extinktionen bei 405 nm gegen die Kontrolle ablesen und die Werte in die umstehende Tabelle eintragen.
Aus deltaE405 nm /10 min die Reaktionsgeschwindigkeit in den Inkubationsansätzen und die molekulare Aktivität (bzw. kcat,) des Enzyms in Sekunden-1 bezogen auf eine Molekularmasse von 100'000 Da berechnen (Verdünnungen berücksichtigen!). Der Extinktionskoeffizient des p-Nitrophenolat-Anions beträgt 18400 M-1 cm-1.
| Temperatur |
1/T |
DE405 nm/10 min |
v |
v/60x[Enzym] |
ln(kcat) |
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.. °C |
... K |
..... x10-3 |
...... |
....... |
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.. °C |
... K |
..... x10-3 |
...... |
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.. °C |
... K |
..... x10-3 |
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....... |
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.. °C |
... K |
..... x10-3 |
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.. °C |
... K |
..... x10-3 |
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Die Resultate als ln(kcat) gegen 1/T auf Millimeterpapier auftragen.
Die Geschwindigkeit der meisten Reaktionen nimmt zu, wenn die Temperatur erhöht wird. Eine Untersuchung der Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten ergibt, dass sehr viele von ihnen der Arrhenius-Gleichung gehorchen:
(1) kcat = A x e-Ea/RT
A: präexponentioneller Faktor : ein Mass für die Häufigkeit von Zusammens-tössen (hängt von T1/2 ab)
Ea: die Aktivierungsenergie des Uebergangszustands (die minimale kinetische Energie in Stossrichtung für eine erfolgreiche Reaktion)
R: die Gaskonstante (8.3145 J x mol-1 x K-1)
T: die absolute Temperatur
Logarithmierung von (1) ergibt:
(2) ln(kcat) = lnA - Ea/RT
Umformung von (2) ergibt:
(3) ln(kcat) = - Ea/R x 1/T + lnA
Die Arrheniusgleichung besagt: es besteht eine lineare Beziehung zwischen 1/T und ln(kcat). (Aus der Gleichung kann die RGT Regel erkannt werden: eine Erhöhung der Temperatur um 10oC beschleunigt eine Reaktion 2-4 mal).
Fragen
- Welche Messgrösse beeinflusst die Steigung der Geraden der Arrhenius-Gleichung und was bedeutet das qualitativ ?
- Hat die Beschleunigung einer Reaktion einen Einfluss auf die Gleichgewichtskonstante?
