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Kreatinkinase-Aktivität im Serum
Prinzip
Die Kreatinkinase katalysiert folgende Reaktion:
(1) Kreatin + ATP « Kreatinphosphat + ADP
Die Reaktion von rechts nach links dient der raschen Bereitstellung von ATP für die Muskelkontraktion. Die Kreatinkinase kommt im Herz- und Skelettmuskel in hoher Konzentration vor.
In diesem Experiment wird die Aktivität der Kreatinkinase aus der Geschwindigkeit der Bildung von ADP gemessen (Reaktion (1) von links nach rechts). Da die Geschwindigkeit der Bildung von Kreatinphosphat und ADP nicht direkt mit einer optischen Methode bestimmt werden kann, wird die Reaktion (1) mit den Hilfsreaktionen (2) und (3) gekoppelt:
(1) Kreatin + ATP <===> Kreatinphosphat + ADP
(2) ADP + Phosphoenolpyruvat <===> ATP + Pyruvat
(3) Pyruvat + NADH + H+ <===> Lactat + NAD+
Gesamtreaktion:
(4) Kreatin + Phosphoenolpyruvat + NADH <===> Kreatinphosphat + Lactat + NAD+
Reaktion (2) wird durch Pyruvatkinase, Reaktion (3) durch Lactatdehydrogenase katalysiert. Die Geschwindigkeit der Reaktion (3) kann photometrisch aus der Abnahme der Extinktion bei 340 nm gemessen werden. Die gesuchte Geschwindigkeit der Reaktion (1) ist gleich der gemessenen Geschwindigkeit der Reaktion (3), sofern die gekoppelten Hilfsreaktionen (2) und (3) viel schneller als die Reaktion (1) ablaufen und ihre Gleichgewichte rechts liegen. Die Enzyme der Hilfsreaktionen sowie die im System nicht erzeugten Substrate müssen selbstverständlich dem Ansatz zugefügt werden.
Lösungen
- Kreatinkinase enthaltendes Serum
- NADH (0.5 mM), ATP (6 mM), Phosphoenolpyruvat (2 mM)
in Glycinpuffer (2 M),pH 9 - Lactatdehydrogenase (2 mg/ml), Pyruvatkinase (2 mg/ml)
- Kreatin (63 mM) in Glycinpuffer (0.1 M), pH 9
Ausführung
Photometeranzeige ohne Küvette im Lichtweg auf E340 nm = 0.0 einstellen. Lösungen gemäss Schema der Reihe nach in eine Küvette pipettieren:
- Lösung 1 (Serum) 0.50 ml
- Lösung 2 (NADH) 0.70 ml
- Lösung 3 (LDH, PK) 0.05 ml
- Küvette in Photometer stellen und Schreiber starten, Zugabe Lösung 4
- Lösung 4 (Kreatin) 1.75 ml
- Totalvolumen 3.00 ml
- Lösung 2 (NADH) 0.70 ml
Sofort nach Zugabe von Lösung 4 Küvetteninhalt mischen (sorgfältig 3-4 mal mit der Pipette hochziehen) und die Extinktion über 10 Minuten aufzeichnen, dann Schreiber stoppen. Skalabereich der Ordinate von 0 bis 100 entspricht einer Extinktion von 1.0
Auswertung
Extinktionsänderung pro Minute (delta E/min) aus der Steigung im linearen Bereich der Kurve bestimmen. Daraus die Enzymaktivität als Anzahl U (1 U entspricht 1 µmol Substratumsatz pro Minute) pro ml im Serum und die Konzentration der Kreatinkinase im Serum in mg/ml berechnen. Der molare Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm beträgt 6220 M-1 cm-1. Die spezifische Aktivität reiner Kreatinkinase beträgt unter den hier verwendeten Versuchsbedingungen 8 U/mg.
