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Bestimmung von Km und Vmax der sauren Phosphatase
Prinzip
Für die Bestimmung von Km und Vmax wird die Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Substratkonzentrationen gemessen. Temperatur, pH und Enzymkonzentration werden konstant gehalten. Die Substratkonzentration wählt man gewöhnlich zwischen dem 0.1-fachen und 10-fachen des mutmasslichen Km Wertes. Die in diesem Versuch verwendeten Konzentrationen sind so gewählt, dass die Werte über den Messbereich vernünftig verteilt sind.
In diesem Experiment werden Km und Vmax in Abwesenheit (Ansatz A) bzw. in Anwesenheit (Ansatz B) eines Inhibitors der sauren Phosphatase (Natriumorthovanadat) bestimmt. Aus dem Verlauf der Michaelis-Menten Kurven kann beurteilt werden, wie der Inhibitor wirkt.
Ansatz A: ohne Inhibitor
Lösungen
- 0.2 M Na-Acetatpuffer, pH 5.0
- Saure Phosphatase aus Kartoffeln (11 µg/ml)
- 30 mM p-Nitrophenylphosphat;
- 3 mM p-Nitrophenylphosphat;
- 0.5 mM p-Nitrophenylphosphat
- 0.25 M NaOH
- Saure Phosphatase aus Kartoffeln (11 µg/ml)
Ausführung
Folgende Inkubationsansätze vorbereiten (ml):
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A |
B |
C |
D |
E |
F |
G |
H |
I |
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Puffer |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
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Substrat, 30 mM |
0.20 |
0.05 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
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Substrat, 3 mM |
- |
- |
0.20 |
0.15 |
0.10 |
0.05 |
- |
- |
- |
|
Substrat, 0.5 mM |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
0.20 |
0.15 |
- |
|
H2O |
- |
0.15 |
- |
0.05 |
0.10 |
0.15 |
- |
0.05 |
0.20 |
Inhalt der RG A bis I mischen und RG ins 37 oC-Wasserbad stellen. In einem weiteren RG ca. 2 ml der Enzymlösung ebenfalls ins 37 oC-Wasserbad stellen.
Nach 5 Min in genau 0.5-minütigen Abständen je 0.2 ml der vorgewärmten Enzymlösung zu den Proben A - I geben.
Nach 15 Min bei 37 oC (d.h. 15 min nach der Zugabe von Enzym zu Probe A) 3.4 ml NaOH aus automatischer Pipette wiederum in genau 0.5-minütigen Abständen zu den Proben A - I geben.
Extinktionen bei 405 nm gegen Probe I (Kontrolle) ablesen und Werte in die Tabelle eintragen. Daraus die Konzentration des Produktes, [P], in den Inkubationsansätzen berechnen (Volumen = 0.6 ml).
Der Extinktionskoeffizient des p-Nitrophenolat-Anions beträgt
18400 M-1 cm-1.
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Probe
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[S] (mM) |
E405 |
[P] (mM) |
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A |
10 |
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B |
2.5 |
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C |
1 |
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D |
0.75 |
|
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E |
0.5 |
|
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|
F |
0.25 |
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|
G |
0.166 |
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|
|
H |
0.125 |
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Bestimmung von Km und Vmax
Resultate im bereitgestellten Computer in die Auswertungsvorlage eingeben. Die Vorlage ermöglicht eine direkte Bestimmung von Km und Vmax mit einer Lineweaver-Burk Analyse. Die molekulare Aktivität (min-l) des Enzyms bezogen auf eine Molekularmasse von 100'000 Da berechnen.
